• MIPAAF – Ministero delle Politiche Agricole, Alimentari e Forestali

• HYDROBIO - Ottimizzazione della produzione biologica di idrogeno da Chlamydomonas

I combustibili fossili rappresentano la principale fonte energetica utilizzata nella nostra economia. A causa dell’intenso sfruttamento, le riserve mondiali di questi combustibili sono destinate all’e-saurimento e, entro alcuni decenni, sarà necessario rimpiazzarli. Il loro uso massiccio, inoltre, cau-sa un accumulo nell’atmosfera di gas ad effetto serra e il conseguente possibile aumento della temperatura terrestre. Per queste ragioni lo sviluppo di fonti energetiche alternative, rinnovabili e con un basso impatto ambientale, è da considerarsi una priorità. L’idrogeno è stato da tempo indi-cato come un ottimo candidato per essere utilizzato come vettore energetico: esso, infatti, ha un elevato contenuto energetico per unità di peso e la sua combustione produce unicamente acqua. Tuttavia, l’idrogeno libero allo stato gassoso non è disponibile in natura e deve essere prodotto estraendolo dalle sostanze in cui si trova combinato come l’acqua e il gas metano.

A questo scopo risulta di particolare interesse la capacità di alcuni organismi viventi di produrre H2 in processi metabolici accoppiati con la fermentazione, la fissazione di azoto o la fotosintesi nel caso delle alghe. Queste ultime, in particolare, sono in grado di estrarre direttamente dall’acqua il potere riducente (elettroni) necessario a ridurre i protoni e sintetizzare idrogeno gassoso utilizzan-do l’energia della luce solare. Questo è, in assoluto, il processo più diretto, e quindi termodinami-camente più efficiente per la produzione di idrogeno, ed è anche il più “pulito” dal punto di vista ambientale in quanto non è associato ad emissione di alcun gas ad effetto serra.

La capacità di produrre idrogeno da parte delle alghe verdi unicellulari fu osservata da Gaffron nel 1942 (1) che mostrò come una coltura di alghe adattata al buio in condizioni di anaerobiosi se illu-minata era in grado di evolvere idrogeno utilizzando il potere riducente prodotto dalla catena di trasporto elettronico fotosintetico. La reazione di produzione di idrogeno in questi organismi è possibile grazie alla presenza di alcuni enzimi chiamati idrogenasi che sono appunto in grado di  ca-talizzare la sintesi di idrogeno molecolare a partire da protoni (H+) e elettroni. Sfortunatamente  però, l’evoluzione di H2 è soltanto transitoria: dopo alcuni minuti di illuminazione, l’ossigeno  pro-dotto dal fotosistema II (PSII) inibisce l’idrogenasi e la produzione di idrogeno cessa. Quindi, nono-stante questa reazione abbia un potenziale applicativo notevole, l’inibizione del processo da parte dell’ossigeno, uno dei principali prodotti della fotosintesi, ha per lungo tempo limitato ogni possi-bile applicazione pratica.

Una possibilità per superare questo limite consiste nella ricerca di idrogenasi più resistenti alla ini-bizione da ossigeno. Un organismo particolarmente interessante è il batterio termofilo Thermtoga neapolitana, del quale è stato recentemente dimostrata la capacità di produrre idrogeno anche in condizioni di micro-aerobiosi, in presenza cioè di concentrazioni di ossigeno attorno al 5-6% (2-3). Lo studio di questo organismo e del suo enzima idrogenasi è quindi di grande interesse per com-prendere i meccanismi della sensibilità/resistenza  all’ossigeno ma anche per utilizzare l’enzima re-sistente per la produzione di idrogeno in presenza di ossigeno, eventualmente inserendolo anche in altri organismi.

A questo scopo nei laboratori proponenti è stato intrapreso lo studio dei geni che codificano per l’idrogenasi di questo organismo. Questa proteina è una Fe-Fe idrogenasi eterotrimerica composta cioè di tre sub-unità diverse e le sue grosse dimensioni potrebbero essere all’origine della maggio-re resistenza all’inibizione da ossigeno. Risultati preliminari dimostrano che tutte le proteine su menzionate sono espresse efficacemente in batteri. La subunità catalitica (Hydα), che lega il sito attivo (cluster H), è stata  espressa anche se la maggior parte di essa si trova non correttamente ripiegata sotto forma di corpi d’inclusione. Tuttavia la sua espressione anaerobia in combinazione con tre proteine accessorie all’assemblaggio del cluster H (HydE, F e G), recentemente identificate in tutti gli organismi contententi Fe- Fe idrogenasi, ha fornito le prime indicazioni di un corretto folding; sulla proteina così espressa è stato possibile rilevare l’attività di evoluzione di idrogeno e la pre-senza di un cluster H correttamente assemblato mediante spettroscopia EPR.

Questo progetto si propone di approfondire questi incoraggianti risultati preliminari procedendo con lo studio dell’idrogenasi di T. neapolitana. In particolare si intende: 

a. Ottimizzare dell’espressione dell’idrogenasi di T. neapolitana in E. coli: i livelli di espressione di proteina solubile correttamente assemblata e attiva sono infatti ancora piuttosto bassi, e non  sempre riproducibili, rendendo più difficile lo studio.

b. Esprimere l’idrogenasi di T. neapolitana in un sistema eterologo alternativo, Clostridium acetobutylicum: è stato infatti dimostrato di recente (4) che questo organismo possiede delle pro-teine accessorie all’assemblaggio del cluster H (HydG, E, F) particolarmente efficienti e versatili, rendendolo in grado di esprimere e assemblare Fe-Fe idrogenasi eterologhe ad alta attività speci-fica.

c. Identificare mediante analisi mutazionale residui con un ruolo nella resistenza dell’enzima alla presenza di ossigeno

L’ obiettivo più a lungo termine, una volta caratterizzata la proteina e la sua attività, è quello di sovraesprimere l’idrogenasi parzialmente resistente all’ossigeno nell’alga Chlamydomonas reinhardtii. A questo scopo la strategia scelta è quella di trasformare il genoma cloroplastico di quest’alga, al fine di sfruttare i numerosi vantaggi che questa tecnica offre. Grazie alla trasfor-mazione cloro plastica, infatti, è possibile ottenere grosse quantità di proteina. Inoltre, permet-terebbe di esprimere la proteina nell’organello sede della reazione di produzione di idrogeno, eli-minando il problema dell’import attraverso la membrana cloroplastica. La sovraespressione del-l’enzima di T. neapolitana in C. reinhardtii permetterà di aumentare in modo molto rilevante l’ef-ficienza del sistema di produzione di idrogeno basato sull’attività fotosintetica dell’alga. Per otte-nere però questo auspicabile risultato occorrerà mettere a punto il sistema di trasformazione del genoma cloroplastico.

Una ulteriore parte del progetto riguarda lo studio della regolazione dello stato redox nelle cellule di C. reinhardtii. Per comprendere perché questo tipo di studio abbia un forte interesse per la pro-duzione di idrogeno bisogna considerare che gli elettroni utilizzati per la produzione dell’idrogeno gassoso derivano dalla catena di trasporto fotosintetica ed in particolare dal fotosistema I di cui l’i-drogenasi costituisce un accettore. Tuttavia, in questo ruolo l’idrogenasi compete con altri pro-cessi di trasporto elettronico quali la riduzione NADP+, e la fotofosforilazione ciclica. Inoltre, nelle alghe, gli elettroni trasportati nella catena fotosintetica derivano, nelle condizioni di parziale anaerobiosi in cui si ha produzione d’idrogeno, da due fonti principali: l’acqua, attraverso l’attività del PSII, e le riserve di carbonio, attraverso la fermentazione e la respirazione.

La produzione di idrogeno, quindi, coinvolge diversi processi che avvengono sia a livello del cloro-plasto che a livello del mitocondrio. La regolazione della produzione di idrogeno dipende, quindi, dalla concertazione di più vie biochimiche cellulari le cui interazioni e regolazioni non sono del tut-to chiare. Tutte queste vie però hanno un effetto sullo stato redox della cellula e dei suoi diversi compartimenti: una comprensione più approfondita della regolazione dello stato redox cellulare è quindi di fondamentale importanza al fine di migliorare le rese di produzione di idrogeno.

Questa parte del progetto si propone di fare avanzare la conoscenza in questo campo e si occu-perà dello sviluppo di ceppi di Chlamydomonas in cui lo stato redox possa essere monitorato in maniera efficace. A questo scopo sono già in via di costruzione ceppi di Chlamydomonas in cui è stato inserito un gene codificante una roGFP, una proteina fluorescente che è sensibile allo stato redox (5). Monitorando la fluorescenza di questa proteina si possono perciò avere informazioni sullo stato redox nelle diverse condizioni. Ad esempio, questa misura in cellule trattate con diverse intensità di luce permetterà di stabilire come queste siano in grado di utilizzare la luce e quindi in-trodurre potenziale riducente all’interno della cellula. Al contrario in condizioni di buio questa mi-sura può dare un’indicazione della capacità di mobilitare le riserve carboniose mediante la respi-razione, sia cloroplastica che mitocondriale.

I ceppi sovra esprimenti la GFP saranno poi in futuro utilizzabili per la costruzione di una collezione di mutanti di inserzione casuale. Uno dei problemi fondamentali di questo approccio consiste nei riarrangiamenti delle regioni fiancheggianti le inserzioni, che rende difficile il loro clonaggio trami-te tecniche PCR. Per superare questo ostacolo, si tenterà di mettere a punto un metodo di muta-genesi inserzionale “pulita”, basato sull’uso del tDNA di Agrobacterium, che è stato usato con suc-cesso come efficiente mutageno inserzionale in cellule vegetali e fungine (6) e, in un caso, algali (7). Data la vicinanza filogenetica delle piante superiori, che sono l’ospite naturale di Agrobacterium, alle alghe, ci si attende che queste ultime siano prontamente trasformabili con tale metodo.   Comunque siano ottenute, le inserzioni hanno una probabilità significativa di bloc-care la trascrizione di un gene e quindi di generare dei mutanti. Questa ampia collezione di mu-tanti sarà poi selezionata analizzando il loro spettro di fluorescenza in diverse condizioni di cre-scita. I ceppi che mostreranno uno spettro di fluorescenza alterato saranno i portatori di una mu-tazione che porta all’alterazione del loro stato redox e quindi selezionati.

• Prof. Giorgio Mario Giacometti ( Unità di ricerca: Biochimica )
  e-mail: gcometti@bio.unipd.it

• dr.ssa Paola Costantini, paola.costantini@unipd.it
• dr. Tomas Morosinotto, tomas.morosinotto@unipd.it
• dr.ssa Paola Berto, paola.berto@unipd.it
• dr.ssa Diana Simionato, diana.simionato@unipd.it

Idrogeno, alghe, fotosintesi, resistenza ossigeno, fotobioreattori

• Unità di Padova. Responsabile: Prof. GM Giacometti
• Unità di Verona:. Responsabile: Prof. Roberto Bassi
  Componenti: Luca Dall’Osto, Giulia Bonente, Chiara Govoni, Cinzia Formighieri
• Unità ENEA (Roma Casaccia). Responsabile: Prof. Giovanni Giuliano
  Componenti: Raffaela Tavazza ,Alessia Fiore,  Paola Ferrante